الاصابة التي أبعدت ميسي من اللعب لمدة شهرين في نهاية موسم 2005-06 تهدد وجوده في كأس العالم 2006. ومع ذلك، تم اختيار ميسي في منتخب الأرجنتين للبطولة في 15 مايو 2006. كما انه لعب في المباراة الأخيرة قبل كأس العالم ضد المنتخب الأرجنتيني تحت 20 سنة لمدة 15 دقائق، ومباراة ودية ضد انغولا من الـ64 دقيقة.[146][147] قد شهد فوز الارجنتين في المباراة الافتتاحية ضد ساحل العاج من مقاعد البدلاء.[148] في المباراة المقبلة ضد صربيا والجبل الأسود، أصبح ميسي أصغر لاعب يمثل الأرجنتين في كأس العالم عندما دخل كبديل لماكسي رودريغيز في الدقيقة 74. صنع هدف هرنان كريسبو في غضون دقائق من دخوله المباراة وسجل أيضا الهدف الأخير في الفوز 6-0، مما يجعله أصغر هداف في البطولة وسادس أصغر هداف في تاريخ كأس العالم.[149] بدأ ميسي في مباراة الأرجنتين التالية 0-0 أمام هولندا.[150] في المباراة التالية ضد المكسيك، دخل ميسي بديلا في الدقيقة 84، والنتيجة تعادل 1-1. وكاد أن يسجل هدفاً، ولكنه احتسب تسلل في وقت حاجة الارجنتين إلى هدف في الوقت الاضافي لتمضي قدماً.[151][152] ترك المدرب خوسيه بيكرمان ميسي على مقاعد البدلاء في مباراة الربع النهائي ضد ألمانيا، التي خسرتها الأرجنتين 4-2 في ركلات الترجيح.[153]